摘要：超微量分光光度計目前成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)實驗室蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)等領(lǐng)域。應(yīng)用液體的表面張力特性，檢測時經(jīng)上下臂的接觸拉出固定的光徑，達到快速、微量、高濃度檢測吸光度的特點。本文闡述了如何用現(xiàn)有的國家標準物質(zhì)對超微量分光光度計進行檢測，并舉例說明對超微量分光光度計透射比、波長和雜散光等主要指標檢測方法。最后對超微量分光光度計日常檢測過程中可能遇到的問題并對其進行分析。

分光光度計是一類重要的分析儀器，無論在物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、環(huán)境科學(xué)等研究領(lǐng)域 ，還是在化工、醫(yī)藥、環(huán)境檢測、冶金等現(xiàn)代生產(chǎn)與管理部門 ，紫外可見分光光度計都有廣泛而重要的應(yīng)用。分光光度計就是利用分光光度法對物質(zhì)進行定量定性分析的儀器。由于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量樣本量很小，于是超微量分光光度計應(yīng)運而生。

目前超微量分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器，應(yīng)用液體的表面張力特性，樣品體積只需要0. 5～2μL，在檢測臺上，經(jīng)上下臂的接觸拉出固定的光徑達到快速、微量、高濃度及不用石英管、毛細管等耗材檢測吸光度的特點，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)實驗室蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)等領(lǐng)域。

超微量分光光度計主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統(tǒng)組成，與傳統(tǒng)分光光度計有明顯的不同。二者有以下7點區(qū)別:

(1)所需樣品體積小，僅需0. 5～2μL;

(2)不需要比色皿，用移液槍直接將樣品滴加到檢測平臺上，測量時樣品自動形成液柱，檢測完成后只需用干凈的吸水紙將樣品從檢測平臺上擦拭干凈即可;

(3)一般具有1mm和0.2mm兩個光程(電機控制自動選擇)，而傳統(tǒng)分光光度計的光程為10mm，分光光度計樣品無需稀釋，測量范圍可達到常規(guī)分光光度計的50倍;

(4)氙氣閃光燈為燈源，代替了氘燈(紫外)和鎢燈(可見)，使用壽命更長;

(5)不需要預(yù)熱，可隨時檢測;

(6)顯示吸光度值的同時，程序直接給出濃度值(核酸、蛋白和熒光染料);

(7)體積比傳統(tǒng)分光光度計小很多(用體積數(shù)值表述)。

超微量分光光度計與傳統(tǒng)的紫外可見分光光度計工作原理相同，都是根據(jù)物質(zhì)的分子對紫外、可見區(qū)輻射(光)的選擇性吸收和朗伯－比爾(Lambert－Beer)定律對物質(zhì)進行定量分析和定性鑒別的儀器。

朗伯 － 比爾定律的數(shù)學(xué)表達式為:

A = -lg(I/I ₀ )= -lgT = klc

式中:A—物質(zhì)的吸光度;

I ₀ —入射的單色光強度;

I—透射的單色光強度;

T—物質(zhì)的透射比;

k—物質(zhì)的吸光系數(shù);

l—被分析物質(zhì)的光程;

c—物質(zhì)的濃度。

由此可見，單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液時，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度(光程)成正比。物質(zhì)對光的選擇性吸收波長，以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后，可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸光度，即可由上式計算出供試品中該物質(zhì)的含量。

現(xiàn)行的紫外可見分光光度計檢定依據(jù)為 JJG178－2007《紫外、可見、近紅外分光光度計》國家計量檢定規(guī)程。其中規(guī)定透射比標準物質(zhì):質(zhì)量分數(shù)為 0.06000/1000重鉻酸鉀的0.001mol/L高氯酸標準溶液。分別在 235nm、257nm、313nm、350nm 處測量透射比三次。重鉻酸鉀標準溶液在相應(yīng)波長下不同溫度的透射比值如表 1 所示。

超微量分光光度計檢測方法

透射比準確度和重復(fù)性的測量

分別在 235nm、257nm、313nm、350nm 處，將重鉻酸鉀標準溶液［紫外分光光度計溶液標準物質(zhì) GBW(E)130066］作為樣本進行測量。

首先，超微量紫外可見分光光度計結(jié)果為吸光度值，然而紫外分光光度計溶液標準物質(zhì)(重鉻酸鉀標準溶液)證書的特性量值用透射比表示。其次，超微量紫外可見分光光度計光徑為1mm或0.2mm，和紫外分光光度計溶液標準物質(zhì)內(nèi)徑為10nm的標準石英吸收池定值條件并不一致。這樣就需要對所測出的結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理。

由朗伯－比爾定律 A = klc可知，被測物質(zhì)的光程和吸光度值成正比，可將超微量分光光度計波長為313nm時，光徑為1mm 的吸光度值0. 030，擴大10倍，轉(zhuǎn)化成光徑為10mm的吸光度值為0.300。同理，光徑為 0. 2mm的吸光度值0. 006，擴大50倍，轉(zhuǎn)化成光徑10mm的吸光度值也為0.300。又根據(jù)朗伯－比爾定律 A =-lgT，可得 T =10-A 。超微量分光光度計波長為 313nm 時，T =10-0. 300=50. 1%。

依據(jù) JJG178－2007《紫外、可見、近紅外分光光度計》國家計量檢定規(guī)程要求，分別在 235nm、257nm、313nm、350nm 處測量透射比三次。透射比最大允許誤差≤ ±2. 0%，透射比重復(fù)性≤1. 0%，符合Ⅳ級儀器指標要求。

波長準確度的測量

掃描氧化鈥的光譜曲線，依次查找 200nm～900nm 的指ding波長，配合圖譜下方的數(shù)據(jù)列表，找出氧化鈥光譜曲線的波峰值(與其對應(yīng)的則是光譜曲線透射比的波谷值)。

依據(jù) JJG178－2007 規(guī)程的計量性能要求，波長在200nm～340nm 區(qū)段，最大允許誤差≤±2nm，波長在340nm～900nm 區(qū)段，最大允許誤差≤± 4nm，波長重復(fù)性≤1nm，符合Ⅳ級儀器指標要求。

雜散光的測量

測量生化分析儀校準用溶液標準物質(zhì)(BW2025)中的亞硝酸鈉標準溶液(注:溶液濃度為 50g/L) 根據(jù)朗伯 － 比爾定律，先將儀器測量的吸光度值轉(zhuǎn)化成光徑為 10mm 的吸光度值:A 10nm = 10A 1nm = 1. 412×10 =14. 12。超微量分光光度計波長為 340nm 時雜散光的結(jié)果，轉(zhuǎn)化成 T =10^－A=10^{－14. 12}=0. 0%。依據(jù) JJG178 －2007 規(guī)程的計量性能要求，儀器雜散光(透射比)≤0. 1%，符合Ⅰ級儀器指標要求。

常見超微量分光光度計檢測中的問題及分析

超微量分光光度計的零點漂移

用紫外分光光度計標準物質(zhì)(重鉻酸鉀標準溶液)檢測儀器透射比準確度，分別設(shè)置235nm、257nm、313nm、350nm 四點波長，以空白溶液為參比，在對應(yīng)波長下調(diào)零后，用紫外分光標準溶液測量被測儀器的透射比。

測量結(jié)果與紫外可見分光光度計標準物質(zhì)透射比差別較大，且連續(xù)測量 3 次，對測量結(jié)果的影響不大。

經(jīng)過測量結(jié)果數(shù)據(jù)分析，儀器經(jīng)轉(zhuǎn)化后的透射比結(jié)果比標準值小，得出吸光度值原始測量結(jié)果則比吸光度的標準值大，其中發(fā)現(xiàn)吸光度的誤差變化成線性，且誤差均是 0. 10。

這樣將標準空白溶液當成樣本，測量空白溶液吸光度值，發(fā)現(xiàn)空白溶液的吸光度值為 0. 010(被測儀器的光徑為 1mm)。轉(zhuǎn)化成光徑為 10mm 的吸光度對應(yīng)正好也就相差 0. 10。這種方法可以測量出該儀器的零點漂移。把儀器的吸光度的本底減去后符合朗伯 － 比爾定律。

結(jié)束語

通過上述的檢測方法闡述和問題分析，對判斷超微量分光光度計的計量性能有了更加可行的手段和方法。依據(jù) JJG178 － 2007《紫外、可見、近紅外分光光度計》中的要求，并沒有規(guī)定對超微量分光光度計有效的檢測方法。因此結(jié)合計量部門的實際情況，設(shè)計一套有效的檢測方法，使得計量標準得到有效的量值傳遞，也同時解決了超微量分光光度計此前無法量值溯源問題，是值得在今后的工作中加以推廣并完善的。